信帆生物手把手教你做Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)

Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其實(shí)比實(shí)驗(yàn)本身更重要！好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以事半功倍，節(jié)省時(shí)間！尤其做生物實(shí)驗(yàn)，一定要查詢(xún)盡可能*的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)路線。當(dāng)然實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識(shí)，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對(duì)于一個(gè)real-time qPCR而言，首先就是實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計(jì)，這步至關(guān)重要，好的引物是實(shí)驗(yàn)本身成功的50%；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨(dú)說(shuō)明）。

1.  實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備
以zui基本的基因表達(dá)差異分析為例。實(shí)驗(yàn)材料分為對(duì)照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計(jì)意義。在材料收集過(guò)程中，盡量避免RNA的降解（尤其對(duì)于定量的樣品）。
一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對(duì)于異地取材?，F(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類(lèi)的樣品儲(chǔ)存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2.  引物設(shè)計(jì)
一般real-time PCR引物的設(shè)計(jì)遵循下面一些原則：
擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp。
引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。
產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
產(chǎn)物長(zhǎng)度一般在15-30堿基之間。
G+C含量在40%-60%之間。
堿基要隨機(jī)分布。
引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
引物5’端可以修飾。
引物3’端不可修飾。
引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位。
Taqman@探針的設(shè)計(jì)稍有不同，一般有公司設(shè)計(jì)合成。遵循下面以下原則：
盡量靠在上游引物；
長(zhǎng)度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
5’端不要是G，G會(huì)有淬滅作用，影響定量

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Real-time qPCR操作過(guò)程

1.  RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
在抽提RNA過(guò)程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難*抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：

（1）全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來(lái)源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。

（2）使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A或T1來(lái)降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動(dòng)吸管）可能富含RNA酶。

（3）在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無(wú)RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水*漂洗干凈后高壓滅菌備用。
當(dāng)然，這些也不是的要求。如果是操作熟練。*可以用初次開(kāi)封的離心管和槍頭，新過(guò)濾的超純水，進(jìn)行RNA的提取。

2.  Mix配制
一般來(lái)講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來(lái)講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，在操作過(guò)程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)*反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過(guò)程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：

（1）MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，溶解后放在4度。

（2）更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。能在冰上操作。

（3）每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！

（4）所有成分加完后，離心去除氣泡。

（5）每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了?。┗蛘咂渌玖希灰挥绊憴z測(cè)PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來(lái)講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來(lái)形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。

3.  儀器設(shè)置
所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：
A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。
B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。
C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱(chēng)。
D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。
E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備
F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說(shuō)明書(shū)上建議的程序。
G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：

A-G這五個(gè)步驟簡(jiǎn)單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開(kāi)。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒(méi)有參比染料，所以選擇“none”。設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！

Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析
1.  Real-time qPCR常見(jiàn)參數(shù)
基線（baseline）
通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線
閾值（threshold）
自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍
手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。
同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。
Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2.  影響Ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的zui主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。
反應(yīng)液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應(yīng)的效率
PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3.  如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果
PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
 

另一個(gè)評(píng)估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過(guò)Y值來(lái)預(yù)測(cè)X值。R2值大于0.99 時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。
 

標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，偏差的平方根）是zui常用的度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實(shí)際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會(huì)形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^(guò)經(jīng)典的中心極限理論來(lái)證明，獨(dú)立同分布隨機(jī)變量在無(wú)限多時(shí)趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250。

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