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ELISA檢測試劑盒常見問題及解決建議

更新時間:2018-05-11      瀏覽次數(shù):3143
   ELISA檢測試劑盒常見問題及解決建議
  Q1稱樣時,樣品是放在管底還是管口,如果放在管口對檢測結(jié)果有什么影響?
  答:稱量過程中,樣本應(yīng)盡量稱量在試管底部,若樣本粘附在試管口,會使提取液不能與樣本充分接觸,造成提取不充分,從而影響檢測結(jié)果。
  Q2是否可以將樣本提前稱量至離心管放置冰箱冷藏保存,待第二天實(shí)驗(yàn)使用?
  答:建議冷凍保存,并注意避免交叉污染。
  Q3吸取有機(jī)試劑時,有機(jī)試劑容易從槍頭滴落,如何避免?
  答:吸取有機(jī)試劑應(yīng)使用刻度吸管或瓶口分液器。使用移液器吸取有機(jī)試劑會導(dǎo)致移液器的損壞,且吸取量不準(zhǔn)確。飽和蒸氣壓越大的液體(易揮發(fā)液體)越容易出現(xiàn)液滴低落的現(xiàn)象,若必須使用移液器吸取,可將槍頭與移液器緊密連接,減輕滴落現(xiàn)象的發(fā)生。
  Q4前處理時,樣本離心5分鐘和離心10分鐘有什么區(qū)別?
  答:樣本前處理的目的是去除雜質(zhì)以達(dá)到試劑盒能夠檢測的狀態(tài),離心是去除雜質(zhì)的一種手段。離心可以分離液-液,液-固等非均一體系,離心的效果與需要分離的兩相性質(zhì)有很大關(guān)系:若固體樣本的顆粒較小不易分離,則離心所需時間較長;若液體樣本與提取液極性相差較大且不易發(fā)生乳化,則離心所需時間較短。試劑盒說明書中提到的離心時間是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得到的,建議按照說明書操作。
  Q5離心轉(zhuǎn)速和離心力有什么區(qū)別?
  答:離心轉(zhuǎn)速有相對離心力(RFC,單位g)和每分鐘轉(zhuǎn)速(rpm,單位r/min)兩種表達(dá)方式,兩者換算公式為RFC=1.118*10-6*(rpm)2*r,其中r為旋轉(zhuǎn)半徑。維德維康試劑盒實(shí)驗(yàn)過程中使用的離心力為4000g,應(yīng)避免與4000r/min混淆。
  Q6藥物殘留檢測實(shí)驗(yàn)中對水質(zhì)的要求:三蒸水、蒸餾水、純凈水還是去離子水?
  答:理論來說這幾種水均可滿足分析要求,但對于某些項目有一定的區(qū)別。建議使用去離子水和三蒸水,蒸餾水和純凈水一般僅用于洗滌液的配置。
  Q7器具污染所造成的原因有哪幾種?
  答:①檢樣過程中出現(xiàn)含量較高的陽性樣品;
  ②實(shí)驗(yàn)器具沒有清洗干凈;
 ?、蹖?shí)驗(yàn)人員用藥污染或其他外源性污染;
 ?、芨邼舛葮?biāo)品儲備液保存不當(dāng)造成污染。
  建議:易被污染或使用周期較長的實(shí)驗(yàn)器具,定期(3-5個月)更新一次。
  Q8同一個樣品檢測兩次,檢測值差異較大,可能是由于什么原因?qū)е碌模?/div>
  答:正常情況下,板孔間的變異不會對樣本的檢測結(jié)果造成影響,可能造成此結(jié)果的情況有:
  ①某一實(shí)驗(yàn)操作前處理發(fā)生污染或失誤(稱樣量、添加樣品提取液或有機(jī)溶劑的量不準(zhǔn)確,渦動離心提取上層清液時混入大量雜質(zhì));
 ?、谀骋粚?shí)驗(yàn)檢測分析過程出現(xiàn)失誤(添加樣品的量,酶或抗體的量,添加AB液或終止液的量不準(zhǔn))。
  Q9藥殘檢測時,樣品前處理過程中所用氮?dú)饪煞裼脡嚎s空氣代替?
  答:一般情況下,需要檢測的目標(biāo)物是比較穩(wěn)定的藥物,可以用壓縮空氣代替氮?dú)?。如有特殊藥物可能發(fā)生氧化影響檢測結(jié)果,則不可以使用壓縮空氣,具體藥物可向廠家咨詢。
  Q10添加回收率實(shí)驗(yàn)中添加濃度如何選擇?
  答:添加回收率是驗(yàn)證整個實(shí)驗(yàn)過程準(zhǔn)確度的指標(biāo)之一。添加濃度的選擇盡量避免在zui低檢測限以內(nèi)或者超出試劑盒曲線外的濃度,建議參照目標(biāo)藥物在相應(yīng)樣品中的判定限、定量限或曲線中間范圍濃度。同時,需根據(jù)具體的添加濃度對所用高標(biāo)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?,保證添加量的準(zhǔn)確性。
  添加回收的體積公式:V=C*1000M/P
  其中:V為添加的高標(biāo)體積(μl),C為添加的濃度(ppb),P為高標(biāo)的濃度(ppb),M為樣本的質(zhì)量(g)。
  Q11樣本的吸光度值為什么會超出曲線上zui大OD值?
  答:①標(biāo)準(zhǔn)品回溫時間不夠;
 ?、跇颖局泻蟹菢颖净|(zhì)的物質(zhì),如有機(jī)溶劑;
  ③樣本復(fù)溶液稀釋錯誤或直接用去離子水作為復(fù)溶液;
 ?、芰銟?biāo)品被污染;
 ?、莘磻?yīng)時間錯誤;
  樣本的抑制率在100%-120%范圍內(nèi),一般可以初步判斷樣本為陰性。若大部分樣本的抑制率遠(yuǎn)超過120%,建議咨詢或重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
  Q12吹干步驟為什么選擇水浴或金屬浴?
  答:有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)一般在60-90℃不等,為加快有機(jī)試劑的揮發(fā),選擇水浴加熱或金屬浴加熱。加熱溫度應(yīng)根據(jù)待測化合物的性質(zhì)與提取試劑的沸點(diǎn)來確定,若待測化合物熱穩(wěn)定性好,不易降解或變性,可適當(dāng)提高氮吹溫度。建議使用說明書中給出的溫度。
  Q13回收率能否驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程及數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性?
  答:一般用質(zhì)控樣品(已知濃度的樣品)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來反映檢測的準(zhǔn)確性。在沒有質(zhì)控樣本對照的情況下,空白樣本添加回收率是對操作準(zhǔn)確性、操作環(huán)境及分析試劑的評價指標(biāo)之一。因此,回收率也是實(shí)驗(yàn)成功與否的一個重要判定依據(jù)。
  在ELISA檢測方法實(shí)際應(yīng)用過程中,回收率只是一個參考指標(biāo),其值只要穩(wěn)定在一定范圍內(nèi),檢測結(jié)果即具有參考性。
  Q14同一個樣品,*次檢測顯示強(qiáng)陽性,第二次檢測時卻顯示陰性,什么原因?
  答:①點(diǎn)樣的過程中出現(xiàn)跳孔;
 ?、诎蹇壮霈F(xiàn)較大的變異系數(shù);
 ?、蹣颖驹谇疤幚磉^程中被污染;
 ?、軜颖净旌喜痪鶆?。
  建議出現(xiàn)高陽性樣本時應(yīng)保留該樣本液,與重新處理好的樣本液一起點(diǎn)樣分析。
  Q15同檢測結(jié)果出現(xiàn)陽性應(yīng)該怎么處理?
  答:應(yīng)及時進(jìn)行復(fù)檢工作。若檢測結(jié)果存在大面積陽性,應(yīng)首先查找原因,并及時復(fù)檢。若復(fù)檢結(jié)果仍為陽性應(yīng)及時保存該樣本,并使用儀器進(jìn)行確證;如復(fù)檢為陰性,則極大可能*次實(shí)驗(yàn)中存在污染或其他失誤導(dǎo)致假陽性。
  Q16冬天實(shí)驗(yàn)室溫度過低可否將試劑盒置于室溫保存?
  答:不可以。冬天晝夜溫差的改變也會對試劑盒的性能造成不可逆的傷害,應(yīng)嚴(yán)格按照說明書規(guī)定保存。
  Q17實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)白板如何排查問題?
  答:出現(xiàn)該問題時要分情況解決:
  1.標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色正常,樣本均為陽性:證明試劑盒性能正常,樣本遭到大面積污染或前處理過程出現(xiàn)重大失誤,建議重新取樣做復(fù)檢。
  2.整板均不顯色或OD值很低:考慮酶和抗體取用錯誤,點(diǎn)板過程過程中的污染(尤其是洗板過程)或廠家技術(shù)人員協(xié)助找到原因。
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