PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類1、蛋白樣品不能反復(fù)凍融;
2、蛋白樣品應(yīng)加蛋白酶抑制劑,以增加蛋白的穩(wěn)定性;
3、細(xì)胞水平要做 Western Blot,一般地 5×106 個(gè)細(xì)胞提取的蛋白夠就足 Western Blot;
4、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑就要溫和得多,建議提取后hao加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性;
5、若轉(zhuǎn)膜不*,可以加大上樣量,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用降低電流延長(zhǎng)時(shí)間,轉(zhuǎn)膜液中甲醇的比例多加 5-10%;
6、如果上樣量超載,可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載 30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試 1.5mm 的 comb;
7、蛋白變性后,-80℃,一兩年沒(méi)有問(wèn)題。關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了);
8、脫脂奶粉中含生物素,如果實(shí)驗(yàn)中有涉及到“生物素”請(qǐng)將封閉液改為 BSA 封閉;
9、做 200kd 以上蛋白的 Western Blot 時(shí)要注意,分離膠hao選擇>7%的;剝膠時(shí)要小心;轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng);要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析);
10、蛋白的上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定,如果要求是定量和半定量的 Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒(méi)有太大的關(guān)系,盡量多上就行了,但是不要超過(guò) 0.3μg/mm2;
11、一抗,二抗的比例是比較重要,調(diào)整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底;
12、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體嗎?
免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構(gòu)象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制,煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和 Western,而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗);
13、抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用,但是如抗體比較珍貴,可反復(fù)使用 2-3 次。稀釋后應(yīng)在 2-3 天內(nèi)使用,4 度保存,避免反復(fù)凍融;
14、NC 膜 PVDF 膜 尼龍膜的差異。
尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物,價(jià)格*;PVDF 膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言: 尼龍膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 480-600μg/cm2,可結(jié)合短至 10bp 的核酸片段;硝酸纖維素膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 80-100μg/cm2,對(duì)于 200bp 的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng);PVDF 膜結(jié)合 DNA 和 RNA 能力可達(dá) 125-300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言:尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合 DNA,結(jié)合不牢固;PVDF 膜結(jié)合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言:尼龍膜較強(qiáng);硝酸纖維素膜較脆,易破碎;PVDF 膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言:尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交,雜交后,探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái);硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用;PVDF 膜可以重復(fù)使用。
15、在做 Western Blot 時(shí),PVDF 膜用甲醇浸泡的目的。
PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán),使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
16、膜、濾紙、膠大小有何講究?
如果用的是半干法,順序?yàn)椋宏帢O-濾紙-膠-膜-濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠面小 1-2mm,而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大 1-2mm。
禁忌:上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸,這樣會(huì)短路,電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。
17、電泳時(shí) Marker 總跑不全所有條帶,即使用增大膠濃度仍不全?
檢查兩種緩沖液 Tris-HCl(pH 8.8 和 pH 6.8),有可能有長(zhǎng)菌現(xiàn)現(xiàn)象,建議重配兩種緩沖液。
18、Western Blot 染色的選擇
(1)陰離子染料是zui常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測(cè)極限可達(dá)到 1.5μg,考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅 S 和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ,以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。
缺點(diǎn)是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。
(2)膠體金,靈敏度高,檢測(cè)范圍可到 pg 級(jí),但染色不穩(wěn)定。
(3)生物素化靈敏度位于 1、2 之間,可用于任何一種膜。
19、轉(zhuǎn)膜液加甲醇的目的是什么?
加甲醇起著一定的固定作用,因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上,因?yàn)?/span> NC 膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。
20、轉(zhuǎn)膜時(shí)何為濕法,何為半干法?
半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng),將膜,膠,濾紙整個(gè)浸泡在 buffer 的 Tank 里轉(zhuǎn)移的,叫濕法;用濾紙吸 buffer 來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。
21、為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致?同樣的電壓可以嗎?
濃縮膠的目的使得 loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠 ,如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來(lái)前進(jìn)入分離膠。
而在分離的理論上(實(shí)際上也是)小電壓長(zhǎng)時(shí)間分離的效果會(huì)更好,但是在操作過(guò)程中沒(méi)有必要等那么長(zhǎng)的時(shí)間,所以就用大電壓快點(diǎn)跑。
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