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產(chǎn)品分類信帆生物帶您走進(jìn)免疫熒光技術(shù)
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免疫熒光
免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
技術(shù)特點(diǎn):
該技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問題尚未完*,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無放射性污染,并且大多操作簡便,便于推廣。國外生物試劑的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生物試劑。
由于一般熒光測定中的本底較高等問題,熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,在研究檢驗(yàn)中應(yīng)用。
原理:
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反
直接法:
將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢
間接法:
如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為抗體,其它步驟的抗原檢查相同。
標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。
⑴熒光物質(zhì)1)熒光色素許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:⑴異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,大吸收光波長為490--495nm,大發(fā)射光波長520--530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用廣泛的熒光素。
其主要優(yōu)點(diǎn)是:
①人眼對黃綠色較為敏感,
②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
⑵四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:大吸收光波長為570nm,大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。
⑶四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:大吸引光波長為550nm,大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。
⑵其他熒光物質(zhì)1)酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。
例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。
2)鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3 )、鋱(Tb3 )、鈰(Ce3 )等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3 應(yīng)用廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時(shí)間長,適合用于分辨熒光免疫測定。
常見熒光:熒光素1)FITC2)RB2003)TRITC4)鑭系:Eu、Tb5)PE6)其它常見熒光素的特性
1)FITC:黃色結(jié)晶粉末,吸收光:490~495nm,發(fā)射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。
2)RB200:橘紅色粉末,吸收光570nm,發(fā)射光595~600nm,橘紅色熒光。
3)TRITC:紫紅色粉末,吸收550nm,發(fā)射光620nm,橙紅色熒光。
4)鑭系:Eu、Tb
5)PE:吸收光490~560nm,發(fā)射光595nm,紅色熒光。
6)其它:酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。酶作用生物質(zhì)酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光Β-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚體 317 414⑷合適熒光素的選擇
1)具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。
2)熒光效率高,標(biāo)記后下降不明顯。
3)熒光色澤與背景色澤對比鮮明。
4)標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性
5)標(biāo)記方法簡單、快速。
6)安全無毒
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